荧光原位杂交的实验原理是什么

荧光原位杂交的实验原理是什么

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。

杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测;2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3)特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA 探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp 的片段。而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。

唐氏综合症的检查诊断

唐氏综合症检查包括对外周血细胞染色体核型分析、羊水 细胞染色体检查、荧光原位杂交、产前筛查血清标志物、X线片、超声、心电图、脑电图等检查。另外唐氏综合症与先天性甲状腺功能减低症鉴别。

1、对外周血细胞染色体核型分析：细胞遗传学研究发现，21q22区可能是唐氏综合征的基因关键区带，又称为唐氏综合征区。

2、羊水细胞染色体检查：羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合症患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在B超指引下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16-20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。

3、荧光原位杂交：以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。

4、产前筛查血清标志物：采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)，根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。采用这一方法可以检出大约60%的唐氏综合征胎儿。

5、可常规做X线片、超声、心电图、脑电图等检查：部分患儿可发现先天性心脏病，骨龄落后，脑电图异常等改变。

应如何检查唐氏综合症

1.羊水细胞染色体检查

羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合征患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在B超引导下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16～20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。常见核型与外周血细胞染色体核型相同。

2.荧光原位杂交

以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个 21号染色体的荧光信号。若选择唐氏综合征核心区的特异序列作为探针，进行FISH杂交分析，可以对21号染色体的异常部位进行精确定位，提高检测21号 染色体数目和结构异常的精确性。

3.产前筛查血清标志物

采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)。

根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。

4.常规做X线片、超声、心电图、脑电图等检查

部分患儿可发现先天性心脏病，骨龄落后，脑电图异常等改变。

骨髓瘤的检查

1.生化常规检查

血清异常球蛋白增多，而白蛋白正常或减少。尿凝溶蛋白(又称尿本周氏蛋白)半数阳性。

在患者的蛋白电泳或M蛋白鉴定结果中会出现特征性的高尖的“M峰”或“M蛋白”。故常规生化检查中，若球蛋白总量增多或蛋白电泳中出现异常高尖的“M峰”，应到血液科就诊，除外骨髓瘤的诊断。

2.血常规检查

贫血多呈正细胞、正色素性，血小板正常或偏低。

3.骨髓检查

浆细胞数目异常增多≥10%，为形态异常的原始或幼稚浆细胞。

4.骨骼X线检查

可见多发性溶骨性穿凿样骨质缺损区或骨质疏松、病理性骨折。

对于MM患者的骨损害，一般认为CT、核磁共振(MRI)等发现病变的机会早于X线检查;这些影像学手段检查对骨损害病变的敏感性依次为：PET-CT>MRI>CT>X线。

5.染色体、荧光原位杂交技术(FISH)等生物学检查

骨髓染色体17p13缺失，和/或t(4;14)和/或t(14;16)异常，往往提示高危。荧光原位杂交技术(FISH)，特别是用CD138(在大多数骨髓瘤细胞表达阳性)磁珠纯化后的FISH即iFISH检查，更能提高检验的阳性率。这一检测已被用于2015年新修订的国际预后分期系统(R-ISS分期系统)中。

6.血清游离轻链检查

较普通的血或尿轻链检查敏感性高，已被国际骨髓瘤工作组(IMWG)专家定义为严格完全缓解(sCR)的疗效标准。若MM患者治疗后，血清游离轻链由阳性转为阴性，其疗效为严格完全缓解。

荧光原位杂交的临床应用有哪些

1、临床细胞遗传学：有助于进一步证实染色体带型，用于确定标记染色体的起源。对于染色体亚显微缺失的检测很敏感，由于诊断显微缺失综合征。

2、产前诊断：染色体异常的产前诊断主要依靠细胞分裂中期染色体的分析，但这一常规细胞遗传学方法需要两至三周完成。而应用生物素标记的染色体特异性探针对未经培养的绒毛细胞或羊水细胞进行原位交杂即可快速诊断常见的三体型及性染色体数目畸变。使用这一方法进行染色体数目异常的产前诊断只需要一天的时间，可以省去复杂的细胞培养及染色体分析过程。另外，FISHA在染色体结构异常的产前诊断中，不仅对那些易位性重排，而且对重复，缺失或者插入性重排都能为确定类型，来源和断裂点提供可靠依据。对标记染色体，环状染色体来源的研究中，FISH也具有高度的敏感性和可靠性。

3、肿瘤诊断：肿瘤细胞的染色体常常发生易位、缺失、倒位与扩增等改变，而肿瘤细胞的分裂指数较低而且分裂相显带困难，经常很难分析。染色体荧光原位杂交技术的应用，使大部分上述改变的阐明大为简化。

4、传染性疾病的诊断：诊断病原体的程序已有报告。

什么是染色体核型分析

染色体核型分析是一种技术，传统上是观察染色体形态，近年来，采用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记，可以精确地检测染色体上DNA链中，单个碱基的突变，从而大大提高了染色体核型分析的精度。

不同物种的染色体都有各自特定的形态结构（包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等）特征，而且这种形态特征是相对稳定的。而采用荧光原位杂交技术，将荧光素标记的探针进行染色体核型特定位点的检测和标记的染色体核型分析，则可通过荧光检测仪器，直接判读反应体系荧光信号的变化强度，直接测定染色体DNA链中单个碱基的突变。

染色体异常需要做哪些化验检查

(1)荧光原位杂交技术，可用来检测患者羊水细胞或染色体，看是否出现异常。

(2)血清学检查。若为Down综合征，通过血清学检查可发现血清素降低，白细胞中碱性磷酸酶增高，红细胞二磷酸葡萄糖增高，过氧化物歧化酶增高50%。Down综合征患儿孕妇在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增高、雌三醇含量降低，也可提示胎儿Down综合征。

(3)羊膜囊穿刺，孕妇可通过行羊膜囊穿刺可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体发育不全。

荧光原位杂交的特点是什么

原位杂交的探针按标记分子类型分为放射性标记和非放射性标记。用同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高，可以通过延长曝光时间加强信号强度，故较灵敏。缺点是探针不稳定、自显影时间长、放射线的散射使得空间分辨率不高、及同位素操作较繁琐等。采用荧光标记系统则可克服这些不足，这就是 FISH技术。FISH技术作为非放射性检测体系，有以下特点。

优点:1、荧光试剂和探针经济、安全;2、探针稳定，一次标记后可在两年内使用;3、实验周期短、能迅速得到结果、特异性好、定位准确;4、FISH可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当;5、多色FISH 通过在同一个核中显示不同的颜色可同时检测多种序列;6、既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。

缺点：不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

唐氏综合症的检查诊断

1、对外周血细胞染色体核型分析：细胞遗传学研究发现，21q22区可能是唐氏综合征的基因关键区带，又称为唐氏综合征区。

2、羊水细胞染色体检查：羊水细胞染色体检查是唐氏综合征产前诊断的一种有效方法，唐氏筛查结果为“高危”的孕妇需要确诊胎儿是否为唐氏综合症患儿。目前产前诊断最常用的技术是羊膜腔穿刺技术，即在B超指引下，将针通过孕妇腹部刺入羊水中，抽取羊水，对胎儿细胞进行染色体分析。适宜孕16-20周的孕妇。除羊膜腔穿刺术外，进行产前诊断的技术还有绒毛活检、胎儿脐静脉穿刺、胎儿镜检查等。

3、荧光原位杂交：以21号染色体的相应部位序列作探针，与外周血中的淋巴细胞或羊水细胞进行杂交，唐氏综合征患者的细胞中可呈现3个21号染色体的荧光信号。

4、产前筛查血清标志物：采用测定孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)进行唐氏综合征筛查的探索已有多年，这是一种怀孕中期指标(13周以后)，根据这3项(也可测定HCG和AFP两项)血清学指标以及孕妇年龄、体重来推算怀有唐氏综合征患儿的风险率，根据风险率的高低再进一步进行确诊检查。采用这一方法可以检出大约60%的唐氏综合征胎儿。

5、可常规做X线片、超声、心电图、脑电图等检查：部分患儿可发现先天性心脏病，骨龄落后，脑电图异常等改变。

荧光原位杂交的实验步骤有哪些

仪器设备

1、 医用微波炉;

2、 水浴锅;

3、荧光显微镜;

4、数字显微照相机。

FISH试剂

(1)1×PBS：由10×PBS溶液稀释而成，储存于4℃;

(2)20×SSC(pH7.0);

(3)2×SSC，由20×SSC溶液稀释而成;

(4)25mg/ml蛋白酶K消化液。

(5)变性液(70%甲酰胺+2×SSC，pH7.0)：4ml 20×SSC;8ml蒸馏水;28ml甲酰胺。每次新鲜配制。

(6)杂交后洗涤液： 20×SSC 4ml;蒸馏水16ml;甲酰胺20ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。(7)封闭液I：体积分数5% BSA 3 mL，20×SSC 1 mL，ddH2O 1mL，Tween20 5 μL混合。

(8)封闭液II：体积分数5% BSA 3mL，20×SSC 1mL，goat serum 250 μL，ddH2O 750 μL，Tween20 5 μL混合。

(9)荧光检测试剂稀释液：体积分数5% BSA 1mL，20×SSC 1mL，ddH2O 3mL，Tween20 5μL混合。

实验步骤

1、脱蜡：

1)二甲苯脱蜡3次，每次5min;

2)100%酒精两次，每次2min;

3)移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥。

2、蛋白酶处理:

1)每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。

2) 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20min。

3) ×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1min。

4)梯度酒精脱水(-20℃预冷)。

3、变性：

1)每一个立式染色缸配制40ml变性溶液;

2)78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸;

3)78℃孵育8min;

4) 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2min;

5)空气干燥。

4、杂交：

1)准备探针;

2)取一个较大的湿盒，交叉放置切片;

3)滴10μl探针在切片的组织上，加盖玻片;

4)盖上湿盒盖，37℃孵育12h～16h。

杂交后的水洗：

5)镊子小心去除盖玻片;

6)43℃预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min;

7)2×SSC(37℃)洗两次，每次10min;

8)切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。

检测：

9)从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。

10)每张切片使用30μl～60μl罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min;

11)去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min。

12)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;

13)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;

14)去掉塑料盖膜，把切片放人含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2min;

15)从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出;

16)每张切片滴30μl～60μl抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min;

17)1×PBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：

1)张切片加10μl～20μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2～5ml;

2)尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。

6. 荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

羊水穿刺多久出结果

羊水穿刺多久出结果

羊水穿刺结果一般在术后2-3周出来，但具体还要看所在医院的时间安排。因为羊水穿刺抽取出来的细胞必须经过培养，才会分裂到足够的数量，这个过程通常要7-14天左右。为了减少准妈妈的忧虑，有的医院同时采用间期细胞直接荧光原位杂交，2-3天可获得染色体是否异常的结果。

羊水穿刺的注意事项

术前：

1、如有过敏史，特殊疾病史和其他需要说明的情况，请在术前登记时告知医生。

2、术前三天禁止同房;术前一天需要沐浴;术前10分钟需要排尽小便。

3、若术前3—7天有感冒、发热、皮肤感染等异常情况，请在术前登记时告知医生。

术后：

1、术后至少静坐休息2小时后，方可乘车回家;外地病人当晚最好能在医院的旅馆附近休息，隔天后再回家，避免术后过于劳累。

2、术后24小时内不能沐浴，注意多休息，避免剧烈运动以及搬运重物等体力劳动。

3、术后半个月禁止同房。

4、术后三天里如有腹痛、腹胀、阴道流水、流血、发热等症状，应速到医院妇产科就诊。

染色体异常的检查方法

1、Down综合征血清学检查可见血清素降低，白细胞中碱性磷酸酶增高，红细胞二磷酸葡萄糖增高，过氧化物歧化酶增高50%，但与患者发育异常及智力低下无关。

2、约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增高，雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征，检查结果阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

3、孕妇行羊膜囊穿刺可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体发育不全。

4、染色体检查可用荧光原位杂交技术检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。

染色体异常的实验室检查

在人类大多数细胞核中都有染色体，在细胞分裂时呈现46条杆状结构。染色体由dna和蛋白质组成，大多数基因均位于染色体的dna之中。如果染色体出现异常表现形式，相应的患者就会出现一些对应的机体或智力缺失，本文将为您介绍染色体异常的检查方法。

染色体异常的实验室检查：

1、Down综合征血清学检查可见血清素降低、白细胞中碱性、磷酸酶增高、红细胞二磷酸葡萄糖增高、过氧化物歧化酶增高50%、但与患者发育异常及智力低下无关。

2、约1/3的Down综合征患儿母亲在妊娠4～6个月时血清甲胎蛋白含量增高，血清绒毛膜促性腺激素含量增

产前检查是关键，高、雌三醇含量降低，可提示胎儿Down综合征检查结果。阳性孕妇应行羊膜囊穿刺，检测患者羊水细胞或染色体。

其它染色体异常的辅助检查：

孕妇行羊膜囊穿刺，可发现羊水细胞染色体异常，可以早期筛查Down综合征患儿及其他染色体异常。

染色体检查，可用荧光原位杂交技术检测患者羊水细胞或染色体，如Down综合征可发现21号染色体为三倍体。